中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

　　　出口禽肉中莫能菌素殘留量檢驗(yàn)方法
　　　　　　　　　生物自顯影法 SN 0296一93
Method for the determination of monensin
residues in poultry meat for export
?Bioautography method
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1 主題內(nèi)容與適用范圍
　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口禽肉中莫能菌素殘留量的抽樣、制樣和生物自顯影測(cè)定法。
　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口凍雞中莫能菌素殘留量的檢驗(yàn)。
2　抽樣和制樣
2.1　檢驗(yàn)批
　　以不超過2500件商品為一檢驗(yàn)批。
　　同一檢驗(yàn)批的商品應(yīng)具有相同特征,如包裝、標(biāo)記、產(chǎn)地、規(guī)格和等級(jí)等。
2.2　抽樣數(shù)量
　　　　　批量,件　　　　　　　　　　　　zui低抽樣數(shù),件
　　　　　　　　1～25　　　　　　　　　　　　　　　　1
　　　　　　　26～100　　　　　　　　　　　　　　　　5
　　　　　　　101～250 10
　　　　　　　251～500 15
　　　　　　　501～1000　　　　　　　　　　　　　　　17
　　　　　　1001～2500　　　　　　　　　　　　　　　20
2.3　抽樣方法
　　按2.2規(guī)定的抽樣件數(shù)隨機(jī)抽取,逐件開啟。每件至少取一袋作為原始樣品,原始樣
品總量不少于2kg,放入清潔容器內(nèi),加封后標(biāo)明標(biāo)記,及時(shí)送交實(shí)驗(yàn)室。
2.4　樣品制備
　　從每袋原始樣品中取出部分有代表性樣品,將可食部分放入高速組織搗碎機(jī)中搗碎均
勻,充分混勻,用四分法縮分出不少于1kg試樣。裝入清潔容器內(nèi),加封后標(biāo)明標(biāo)記。
2.5　樣品保存
　　將試樣于?18℃冷凍保存。
　　注：在抽樣及制樣過程中,必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。
3　測(cè)定方法
3.1　方法提要
　　用甲醇提取肉樣中莫能菌素,經(jīng)四氯化碳萃取后濃縮至干,以甲醇溶解殘留物,用薄
層分離,再用生物自顯影法測(cè)定。
3.2　設(shè)備和材料
3.2.1　微量注射器：50 μL。
3.2.2　薄層板：硅膠,Q/YT 257?85SG,5cm×20cm,使用前110℃活化2h。
3.2.3　展開缸：240mm×57mm×32mm。
3.2.4　游標(biāo)卡尺：測(cè)量范圍0～200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈測(cè)量儀測(cè)量。
3.2.5　離心機(jī)：轉(zhuǎn)速3000 r/min。
3.2.6　旋轉(zhuǎn)濃縮器。
3.2.7　恒溫培養(yǎng)箱：37±1℃。
3.2.8　高壓滅菌器。
3.2.9　長方形培養(yǎng)皿：20cm×10cm×5cm。
3.2.10 均質(zhì)器：帶均質(zhì)杯250mL。
3.3　試劑和培養(yǎng)基
3.3.1　試劑
3.3.1.1　甲醇：分析純。
3.3.1.2　四氯化碳：分析純。
3.3.1.3 乙酸乙酯: 分析純。
3.3.1.4　莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)品: 960μg(效價(jià))/mg(中國獸藥監(jiān)察所提供)。
3.3.1.5　試驗(yàn)菌種：枯草桿菌(Bacillus subtilis), 菌種號(hào)ATCC 6633(衛(wèi)生部藥品生物
制品檢定所提供)。
3.3.2　培養(yǎng)基
3.3.2.1　菌種用培養(yǎng)基(見附錄A 第A1章)。
3.3.2.2　生物自顯影用培養(yǎng)基(見附錄A第A2章)。
3.3.2.3　肉湯培養(yǎng)基(見附錄A第A3章)。
3.4　測(cè)定步驟
3.4.1 工作液制備
3.4.1.1　莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)貯備液
　　準(zhǔn)確稱取適量的莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解配制成濃度為500μg(效價(jià))/mL的莫能
菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后于冰箱中保存,一周內(nèi)使用。
3.4.1.2　莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液
　　吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用甲醇分別稀釋成2,3,4,5,10和15μg(效價(jià))/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作
標(biāo)準(zhǔn)液。以上稀釋液均須當(dāng)日配制。
3.4.1.3　菌種培養(yǎng)及芽胞菌懸浮液制備
　　將菌種安瓿瓶的上部消毒后敲碎,加入少量肉湯培養(yǎng)基,使其溶解并移至肉湯管中混
勻。置37±1℃溫箱中培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)物接種于菌種培養(yǎng)基中,置于37±1℃培養(yǎng)一周,
鏡檢含芽胞菌數(shù)達(dá)85%以上, 便可制備芽胞懸浮液。
　　用適量滅菌生理鹽水沖洗菌苔,然后將該菌液轉(zhuǎn)移至離心管中,充分搖勻后,于3000
r /min離心30min, 棄去上清液,再加入同樣量的滅菌生理鹽水重復(fù)離心一次。棄去上清
液,再加入適量滅菌生理鹽水,搖勻后于65℃水浴中加熱30min,然后,于1000 r/min離
心5min, 取上清液并轉(zhuǎn)入滅菌試管中,即為芽胞菌懸浮液,置于冰箱中保存,可使用一個(gè)
月。
3.4.2　試液制備：準(zhǔn)確稱取絞碎試樣10g(至0.1g)于均質(zhì)杯中,加入20mL甲醇,均質(zhì)
2min后,移入離心管中,于3000 r/min離心20min。取其上清液15mL,轉(zhuǎn)入盛有5mL蒸餾水
的250mL分液漏斗中,混合后加入10 mL四氯化碳,充分振搖,靜置分層,放出四氯化碳層
于150 mL茄形瓶中。用四氯化碳再重復(fù)提取兩次, 合并四氯化碳至上述茄形瓶中, 于50～
60℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至干,加入0.5mL甲醇溶解殘留物供TLC實(shí)驗(yàn)用。此樣液中相
當(dāng)于禽肉試樣濃度為15g/mL。
3.4.3　測(cè)定
3.4.3.1 生物自顯影
　　將每個(gè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液分別點(diǎn)在四塊薄層板上,先于每塊薄層板下端2cm處劃一條基
線,然后在這條基線上分別點(diǎn)20μL試液和3μg(效價(jià))/mL莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液,試液和標(biāo)準(zhǔn)
溶液點(diǎn)相距2.5cm。在展開缸中用乙酸乙酯進(jìn)行展開,直至溶劑前沿線距板頂端1.5cm處為
止,取出薄層板,風(fēng)干后備培養(yǎng)用。
　　將薄層板水平置于高壓滅菌的長方形培養(yǎng)皿中,無菌操作將已熔化并冷卻至50～55℃
的生物自顯影用培養(yǎng)基均勻地噴在其表面上,然后用10mL上述接種芽胞菌懸液的培養(yǎng)基鋪
滿整個(gè)薄層板,保持水平,待其凝固,于37±1℃培養(yǎng)18 h。
3.4.3.2　對(duì)照試驗(yàn)
　　除不加試樣外,按上述測(cè)定步驟進(jìn)行。
3.5　結(jié)果計(jì)算和表述
　　經(jīng)過培養(yǎng)后,在薄層板上與莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)液產(chǎn)生抑菌圈的Rf值(約0.38)相同位置上,
顯現(xiàn)抑菌圈者即為陽性。
　　當(dāng)樣品判定為陽性時(shí),測(cè)量四塊薄層板上的試液及標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的抑菌圈直徑,分別
計(jì)算出平均值。當(dāng)每組四個(gè)直徑值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不超過5%時(shí),并且試液的抑菌
圈直徑與標(biāo)準(zhǔn)溶液(20μL)的抑菌圈直徑近似(直徑相差不超過±1mm),則其樣品中莫能菌
素含量按下式計(jì)算：
c
X＝──
m
式中：X??樣品中莫能菌素的含量,mg/kg；
　　　c??試驗(yàn)中所用的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,μg/mL；
　　　m??zui終試液所代表的禽肉試樣的濃度,g/mL。
4　測(cè)定低限、回收率
4.1　測(cè)定低限
　　本方法測(cè)定低限為0.20mg(效價(jià))/kg。
4.2　回收率
　　回收率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù):莫能菌素濃度在0.20～0.67mg(效價(jià))/kg范圍內(nèi),回收率為81%～
100%。

附　錄 A　
　　　　　　　　　　　　　培養(yǎng)基成分及制備方法
　　　　　　　　　　　　　　　　 (補(bǔ)充件)
A1　菌種用培養(yǎng)基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　牛肉浸膏 5.0g
　　　　　氯化鈉　　　　　　　　　 2.5g
　　　　　瓊脂 15.0g
　　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使其
滅菌后pH為6.5±0.1,分裝于試管或克氏瓶內(nèi),于121℃ 15min高壓滅菌,滅菌后制備成
所需斜面?zhèn)溆谩?/span>
A2　生物自顯影用培養(yǎng)基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　酵母浸膏　　　　　　　　 2.5g
　　　　　葡萄糖 10.0g
　　　　　瓊脂 15.0g
　　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使其
滅菌后pH為6.0±0.1,分裝于錐形瓶內(nèi),于121℃15 min高壓滅菌,備用。
A3　肉湯培養(yǎng)基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　牛肉浸膏　　　　　　　　 5.0g
　　　　　氯化鈉　　　　　　　　　 2.5g
　　　　　蒸餾水 1000mL
　　將上述各成分于蒸餾水中加熱溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調(diào)節(jié)pH,使
其滅菌后pH為7.0±0.1,分裝于試管中,于121℃15min高壓滅菌。

附錄 B　
　　　　　　　　　　　　　　　　檢驗(yàn)程序圖
　　　　　　　　　　　　　　　　 (補(bǔ)充件)
試樣(10.0g) 試驗(yàn)菌培養(yǎng)
┃┃
┃于均質(zhì)杯內(nèi)加入┃
┃ 20 mL甲醇┃
┃┃
均質(zhì)2 min ┃
┃移入離心管┃
┃┃
離心20 min(3000r/min) 菌液制備
┃┃
取上清液(15 mL) ┃
┃轉(zhuǎn)入盛有5mL蒸餾生物自顯影用培養(yǎng)基
┃水的分液漏斗中┃
┃┃
┃┃
加入四氯化碳(10 mL) ┃
┃充分振搖后分取四氯化碳層┃
┃轉(zhuǎn)入茄形瓶中, 再重復(fù)兩次┃
┃┃
合并入上述茄形瓶中┃
┃┃
　　蒸干┃
┃┃
用0.5mL甲醇溶解┃
┃┃
層析┃
┃┃
┗━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━┛
┃
培養(yǎng)
┃
┃
檢定
┃
┃
結(jié)果和表述

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附加說明:
　　本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國國家進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局提出。
　　本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國天津進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局負(fù)責(zé)起草。
　　本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人袁而森、王素琴、李劍影。
　　本標(biāo)準(zhǔn)等同采用日本厚生省檢驗(yàn)方法：畜水產(chǎn)食品中の殘留物質(zhì)檢查法(1990)。
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中華人民共和國國家進(jìn)出口商品檢驗(yàn)局1993-12-28批準(zhǔn) 1994-05-01實(shí)施